Vesicle traffic defects in the wobbler mouse- and human ALS patients skin fibroblasts

MND-félagið	MS-félagið	MND-félagið	MND-félagið	MND-félagið	MND-félagið
Alþjóða-MND	MND-Svíþjóð	HSP í USA	MND í USA	ALS Therapy	VIB-Belgía

  

 

  Alþjóðleg miðstöð rannsókna á hreyfitauga sjúkdómum

International Center for Research on Motor Neuron Diseases

ICRon-MND

  

 

Vesicle traffic defects in the wobbler mouse-

and human ALS patients skin fibroblasts.

 

Páll Ragnar Karlsson.

Þetta er úrdráttur úr fyrirlestri, sem höfundur hélt á fundi hjá MND-félaginu á árinu 2010. Byggði fyrirlesturinn á M.Sc. skýrslu höfundar, sem hann lauk við í júní 2009. Höfundur mun ljúka Ph.D. námi frá Aarhus háskóla í byrjun árs 2013.

 

 ><<>>< 
  

Tilgangur rannsóknarinnar var að koma á fót skimunarprófi fyrir galla í frumuflutningum í frumurækt frá músa-húðfíbróblöstum og mennskum ALS sjúklingum. Hugsunin á bak við rannsóknina byggist á blöðrum í frumum sem flytjast milli svæða. Hugsanlegt er að galli í flutningunum sé úrslitaþáttur fyrir hreyfitaugasjúkdóma líkt og MND. Rannsóknarhópurinn sem ég var hluti af hafði áður séð þennan galla í músafósturvísum. Hér könnuðum við hvort við myndum sjá sama galla í húðfíbróblöstum wobbler músa (dýramódel fyrir MND sjúkdóminn, þ.e. mús sem er með flestöll helstu einkenni hinn mennska MND sjúkdóms), og að hefja rannsóknir frá húðfrumum MND sjúklinga. Skimunarprófinu sem komið var á fót gengur út á eiturefna-upptöku og útbreiðslu mannósa-6-fosfat sameindarinnar.

Ný prótein eru búin til í frymisnetinu (sjá mynd, rough/smooth endoplasmic reticulum). Próteinin eru svo flutt frá slétta frymisnetinu yfir í cis-enda golgi kerfisins í flutningsbólum. Próteinin fara svo í gegn um golgi kerfið og því lengra sem þau fara inn í golgi kerfið, þroskast próteinin og fara svo loks úr golgi kerfinu á trans-hliðinni sem fullþroska prótein. Próteinin eru svo annað hvort nýtt innan frumunnar eða þau flutt út úr frumunni til að sinna verkum sínum. Það er galli í þessum flutningum sem fundist hefur í frumum wobblermúsa-fósturvísa.

Hægt er að kanna hvort flutningsleið próteina á milli þessara tveggja mikilvægu frumulíffæra sé í lagi með því að láta frumurnar taka upp eitur frá kólerubakteríunni. Þegar frumurnar taka eitrið upp ferðast það vanalega í gegn um golgi kerfið líkt og prótein og á að fara út trans megin.

Með því að merkja golgi kerfið með einum lit og kólerueitrið með öðrum er hægt að sjá bæði staðsetningu golgi kerfisins og eitursins með smásjá sem kölluð er confocal smásjá.

Tilraunirnar voru gerðar í frumutækt. Það er að segja húðsýni voru tekin úr heilbrigðum músum og wobblermúsum ásamt fjórum MND sjúklingum og tveimur heilbrigðum ættingjum eins þeirra. Frumur voru síðan ræktaðar út frá þessum sýnum til þess að gera tilraunir á. Á myndinni fyrir neðan má sjá dæmi um hvernig litun í eiturefnaprófi mannafruma lítur út.

Á myndinni eru frumur sem hafa fengið að taka upp kólerueitrið (grænt) í 20 mínútur og á að vera í og við golgi kerfið (rautt). Efri myndalínan sýnir heilbrigðar frumur en sú neðri frumur frá MND sjúklingi.

Það er erfitt að dæma aðeins út frá myndunum hvort það sé meira eitur við golgi kerfið, þar sem það á að vera ef allt sé eðlilegt, hjá MND sjúklingnum eða hjá heilbrigða ættingjanum. Út frá vísindalegu sjónarmiði er það heldur ekki nægjanlegt að skoða einungis myndirnar. Það þarf að mæla á einhvern hátt hversu hátt hlutfall af því eitri sem er komið inn í frumuna, er í golgi kerfinu. Það er gert í confocal smásjánni. Hún getur talið alla þá grænu punkta sem eru inn í frumunni – einnig þá sem eru í rauðu punktunum. Tölvan reiknar svo út hlutfall grænna punkta í rauðum punktum og kemur út með tölu frá 0 og upp í 1, þar sem 0 merkir að ekkert eitur er í golgi kerfinu (0%) og 1 merkir að allt eitrið sem er inni í frumunni er staðsett í golgi kerfinu (100%).

Niðurstöður þessara mælinga má sjá á myndunum á næstu síðu. Vinstri hliðin sýnir niðurstöður mælinganna fyrir mýsnar og hægri myndin niðurstöður fyrir mennsku frumurnar. Bláu súlurnar eru heilbrigðar mýs og menn á meðan aðrir litir (hægra megin við bláu súlurnar) eru MND sjúkar (wobbler) mýs og MND sjúklingar. Tveir heilbrigðir einstaklingar voru mældir hjá mönnunum og eru um 20 mælingar á bak við hverja súlu. Á X ásnum (lárétt) er tími í mínútum en á Y ásnum (lóðrétt) er magn eiturs mælt í golgi kerfinu (0.1 = 10% af eitrinu er í golgi kerfinu). Niðurstöðurnar hjá músunum sýna að það er stærðfræðilega marktækur munur á eitri í golgi kerfinu milli músategundanna eftir 10 mínútna upptöku og síðar (mælt var eftir 5, 10, 20 og 40 mínútur), táknað með stjörnu. Þegar MND sjúklingarnir og heilbrigðu ættingjarnir eru bornir saman sést stærðfræðilega marktækur munur eftir 5, 20 og 40 mínútur en einhverra hluta vegna ekki eftir 10 mínútur.

Önnur próf voru einnig gerð, til dæmis var kannað hvar sameindin mannose-6-fosfat er til staðar í frumunum. Ef allt er eðlilegt á sameindin að vera í og við golgi-kerfið. Sé golgi kerfið hins vegar bilað eða ekki til staðar er sameindin á víð og dreif í frumunni. Rannsóknir okkar sýna að sameindin sé meira dreifð hjá wobbler músafrumunum en hjá heilbrigðu músafrumunum. Einnig gerðum við frumuátspróf þar sem við útilokuðum að sjúku frumurnar ættu erfiðara með að taka upp eitur og efni frá umhverfi sínu en heilbrigðu frumurnar. Frumurnar eiga jafn auðvelt með að taka eitrið upp.

Helstu niðurstöður okkar eru að flutningsgallar eru séðir í húðfrumum músafósturvísa, fíbróblöstum úr húð wobbler músa og (amk hér) ALS sjúklinga með SOD1 stökkbreytinguna. Meirihluti MPR gæti verið á röngum stöðum í frumunum, hugsanlega vegna MPR uppsöfnunar í litlum flutningsbólum fyrir neðan svokölluð endosome (Pérez-Victoria, 2008) eða vegna umferðarstíflu við trans golgi kerfið; þau sameinast hvort öðru, sem leiðir til stórra endosomal sameinda (Schmitt-John, P. Karlsson).

Að lokum tókst að setja á fót hagnýtt skimunarpróf til að auðkenna galla í frumuflutningum. Við athuguðum þó aðeins fjóra MND sjúklinga og tvo heilbrigða ættingja eins þeirra. Frekari prófanir þarf því að gera á frumum frá MND sjúklingum. Þá gætum við hafa kynnt fyrstu skrefin að mögulegum meðferðum þar sem hægt er að nota skimunarprófið fyrir lyfjafræðilegri skimun að sameindum með gagnleg áhrif á frumuflutninga.

 ><<>><